Typicky sa nádory vyšetrujú pomocou biopsie tkaniva. Malá vzorka je odobratá z nádoru a genotypizovaná alebo analyzovaná na genetický make-up. Problémom s týmto prístupom je, že biopsie nádory môžu byť náročné. Navyše nádorová biopsia poskytuje len snímku nádoru.
Písanie v Discovery Medicine v roku 2015, Labgaa a spoluautorov uvádzajú nasledujúce informácie o bežnej nádorovej biopsii:
Zo zrejmých dôvodov je ťažké monitorovať vývoj nádoru sekvenčnými biopsiami. Biopsia tiež zrkadlí len jediné miesto nádoru a preto je nepravdepodobné, že by predstavovala celé spektrum somatických mutácií u veľkých nádorov. Alternatívou by bolo získanie viacnásobných biopsií pre ten istý nádor, ale táto možnosť sa nezdá realistická ani presná.
Tekutá biopsia zahŕňa meranie cirkulujúcej DNA (ctDNA) a ďalších vedľajších produktov nádoru v krvných vzorkách získaných od pacientov s rakovinou. Tento objavujúci sa diagnostický prístup sľubuje, že bude rýchly, neinvazívny a nákladovo efektívny.
História kvapalnej biopsie
V roku 1948 Mandel a Métais, pár francúzskych výskumníkov, najprv identifikovali ctDNA v krvi zdravých ľudí. Tento objav bol pred jeho časom a až o desaťročia neskôr sa ctDNA ďalej preskúmala.
V roku 1977 Leon a jeho kolegovia prvýkrát zistili zvýšené množstvo ctDNA v krvi pacientov s rakovinou.
V roku 1989 Stroun a kolegovia identifikovali neoplastické (tj rakovinové) charakteristiky v krvi. Po týchto objavoch niekoľko ďalších skupín identifikovalo špecifické mutácie tumorových supresorov a onkogénov, mikrosatelitovú nestabilitu a metyláciu DNA, čo dokázalo, že ctDNA je uvoľňovaná do obehu nádormi. Hoci vieme, že ctDNA odvodená z nádorových buniek cirkuluje v krvi, pôvod, rýchlosť uvoľňovania a mechanizmus uvoľňovania tejto DNA sú nejasné, pričom výskum prináša konfliktné výsledky. Niektoré výskumy naznačujú, že viac malígnych nádorov obsahuje viac mŕtvych rakovinových buniek a uvoľňuje viac ctDNA. Avšak niektoré výskumy naznačujú, že všetky bunky uvoľňujú ctDNA. Napriek tomu sa zdá, že nádorové nádory uvoľňujú do krvi zvýšené hladiny ctDNA, čím sa ctDNA stáva dobrým biomarkerom rakoviny. Z dôvodu silnej fragmentácie a nízkych koncentrácií v krvi je ťažké izolovať a analyzovať ctDNA. Existuje rozdiel v koncentráciách ctDNA medzi vzorkami séra a plazmy. Zdá sa, že skôr krvné sérum než krvná plazma je lepším zdrojom ctDNA. V štúdii Umetani a kol. Sa zistilo, že koncentrácie ctDNA sú konzistentne nízke v plazme v porovnaní so sérom v dôsledku možnej straty cirkulujúcej DNA počas čistenia, pretože koagulácia a iné proteíny sa eliminujú počas prípravy vzorky.
Podľa Heitzera a kolegov je tu niekoľko konkrétnych otázok, ktoré je potrebné vyriešiť, aby využili diagnostický potenciál ctDNA:
Najskôr je potrebné štandardizovať preanalytické postupy …. Výber metódy izolácie, ktorý zabezpečuje extrakciu dostatočného množstva vysoko kvalitnej DNA, je kritický a ukázalo sa, že preanalytické faktory odberu a spracovania krvi môžu silne ovplyvniť výťažnosť DNA …. Po druhé, jednou z najdôležitejších otázok je nedostatok harmonizácie metód kvantifikácie. Rôzne metódy kvantifikácie, … produkujú rôzne výsledky, pretože tieto merania sú zamerané buď na celkovú alebo len amplifikovateľnú DNA …. Po tretie, menej je známe o pôvode a podrobnom mechanizme uvoľňovania ctDNA a vo väčšine štúdií sa spájajú udalosti, ktoré môžu tiež prispieť k uvoľneniu ctDNA.
Cielené a necielené prístupy
V súčasnej dobe existujú dva hlavné prístupy pri analýze krvnej plazmy (alebo séra) pre ctDNA. Prvý prístup je zameraný a hľadá konkrétne genetické zmeny naznačujúce nádory. Druhý prístup nie je cielený a zahŕňa celkovú analýzu genómu, ktorá hľadá ctDNA odrážajúcu rakovinu. Alternatívne sa sekvenovanie exómu používa ako nákladovo efektívnejší, necílený prístup. Exómy sú časti DNA, ktoré sú prepísané na výrobu proteínu.
Pomocou cielených prístupov sa sérum analyzuje na základe známych genetických mutácií v malej sérii mutácií vodiča.
Mutácie vodičov sa týkajú mutácií v genóme, ktoré podporujú alebo "riadia" rast rakovinových buniek. Tieto mutácie zahŕňajú
KRAS
alebo EGFR . Vďaka technologickému pokroku v posledných rokoch sa cielené prístupy k analýze genómu pre malé množstvá ctDNA stali realizovateľnými. Medzi tieto technológie patrí ARMS (systém refrakčných mutácií amplifikácie); digitálna PCR (dPCR); perličky, emulzie, amplifikácia a magnetické činidlá (BEAMing); a hlboké sekvenovanie (CAPP-Seq).Napriek tomu, že došlo k pokroku v technológii, ktorá umožňuje cielený prístup, cielený prístup sa zameriava len na niekoľko pozícií mutácií (hotspoty) a chýba veľa mutácií vodiča, ako sú gény na potlačenie nádorov.
Hlavným prínosom necieľových prístupov k tekutej biopsii je, že môžu byť použité u všetkých pacientov kvôli skutočnosti, že test sa nespolieha na opakujúce sa genetické zmeny. Opakujúce sa genetické zmeny nepokrývajú všetky druhy rakoviny a nie sú špecifickými signatúrami rakoviny. Napriek tomu tento prístup nemá analytickú senzitivitu a komplexná analýza nádorových genómov zatiaľ nie je možná.
Všimnite si, že cena sekvenovania celého genómu podstatne klesla. V roku 2006 bola cena sekvenovania celého genómu približne 300 000 dolárov (USD). Do roku 2017 klesli náklady na približne 1 000 dolárov (USD) na genóm, vrátane reagencií a amortizácie sekvenčných strojov.
Klinická využiteľnosť kvapalnej biopsie
Počiatočné snahy o použitie ctDNA boli diagnostické a porovnateľné hladiny u zdravých pacientov s pacientmi s rakovinou alebo u pacientov s benígnym ochorením. Výsledky týchto pokusov boli zmiešané, pričom len niektoré štúdie poukazujú na významné rozdiely, ktoré poukazujú na rakovinu, stav bez ochorenia alebo relaps.
Dôvod, prečo sa ctDNA môže použiť len na určitý čas na diagnostiku rakoviny, je to, že variabilné množstvá ctDNA sú odvodené z nádorov. Nie všetky nádory "zbavujú" DNA v rovnakom množstve. Vo všeobecnosti pokročilejšie, rozšírené nádory vylučujú viac DNA do obehu ako skoré lokalizované nádory. Navyše rôzne typy nádorov odovzdali do obehu rôzne množstvá DNA. Časť cirkulujúcej DNA, ktorá je odvodená z nádoru, je veľmi rozdielna v štúdiách a typoch rakoviny v rozmedzí od 0,01% do 93%. Je dôležité poznamenať, že z nádoru je zvyčajne odvodená len menšia časť ctDNA, zvyčajne pochádza z normálnych tkanív. Cirkulujúca DNA môže byť použitá ako prognostický marker ochorenia. Cirkulujúca DNA by mohla byť použitá na sledovanie zmien rakoviny v priebehu času. Napríklad jedna štúdia ukázala, že dvojročná miera prežitia u pacientov s kolorektálnym karcinómom (tj počet pacientov, ktorí ešte žijú najmenej dva roky po diagnostikovaní s kolorektálnym karcinómom) a
KRAS
hotspot mutácie boli 100% u tých bez dôkaz zodpovedajúcej cirkulujúcej DNA. Okrem toho je možné, že v blízkej budúcnosti sa môže cirkulujúca DNA použiť na sledovanie prekanceróznych lézií. Cirkulujúca DNA môže byť tiež použitá na monitorovanie odpovede na liečbu. Pretože cirkulujúca DNA ponúka lepší celkový obraz genetickej štruktúry nádorov, táto DNA pravdepodobne obsahuje diagnostickú DNA, ktorá môže byť použitá namiesto diagnostických DNA, získaných samotnými nádormi.
Teraz sa pozrime na niektoré konkrétne príklady kvapalnej biopsie. Guardant360 Guardant Health vyvinul test, ktorý používa sekvenačnú sekvenciu nasledujúcej generácie k profilovanej cirkulujúcej DNA pre mutácie a chromozomálne prešmykovanie pre 73 génov súvisiacich s rakovinou. Guardant Health publikoval štúdiu o užitočnosti tekutinovej biopsie v onkológii. Štúdia použila krvné vzorky od 15 000 pacientov s kombinovaným 50 typmi nádorov.
Väčšina výsledkov z testu kvapalnej biopsie bola zarovnaná s génovými zmenami pozorovanými v biopsii nádoru.
Podľa NIH:
Guardant360 identifikovali rovnaké kritické mutácie v dôležitých génoch súvisiacich s rakovinou, ako je
EGFR, BRAF,
KRAS
a
PIK3CA pri frekvenciách, ktoré boli veľmi podobné tým, ktoré boli predtým identifikované v prípade vzoriek nádorovej biopsie, štatisticky korelujúcich s 94% až 99%. Ďalej podľa NIH vedci uviedli:V druhej časti štúdie hodnotili výskumní pracovníci takmer 400 pacientov – z ktorých väčšina mala pľúcny alebo kolorektálny karcinóm – ktorí mali k dispozícii výsledky krvnej ctDNA a nádorovej DNA. porovnali modely genómových zmien. Celková presnosť kvapalnej biopsie v porovnaní s výsledkami analýz nádorovej biopsie bola 87%. Presnosť sa zvýšila na 98%, keď sa vzorky krvi a nádorov odobrali do 6 mesiacov od seba. Guardant360 bol presný aj napriek tomu, že hladiny cirkulujúcej DNA v krvi boli nízke. Často sa cirkulujúca nádorová DNA skladá z 0,4 percenta DNA v krvi. Celkovo, pomocou kvapalnej biopsie, výskumníci Guardant boli schopní identifikovať nádorové markery, ktoré by mohli priamo liečiť lekári u 67 percent pacientov. Títo pacienti mali nárok na liečbu schválenú FDA, ako aj na liečebné terapie.
ctDNA a rakovina pľúc
V roku 2016 FDA schválila test mutácie cobas EGFR, ktorý sa má použiť na detekciu
EGFR
mutácií v cirkulujúcej DNA pacientov s rakovinou pľúc. Tento test bol prvou tekutou biopsiou schválenou FDA a identifikovali pacientov, ktorí môžu byť kandidátmi na liečbu cielenou terapiou používajúcou erlotinib (Tarceva), afatinib (Gilotrif) a gefitinib (Iressa) ako liečbu prvej línie a osimeritinib (Tagrisso) liečba druhej línie. Tieto cielené terapie napadajú rakovinové bunky špecifickými
EGFR
mutáciami.Je dôležité, že kvôli vysokému počtu falošne negatívnych výsledkov FDA odporúča, aby vzorka tkanivovej biopsie bola odobratá aj od pacienta, ktorý má negatívnu tekutú biopsiu.ctDNA a rakovina pečene Počet ľudí, ktorí zomreli na rakovinu pečene, sa za posledných 20 rokov zvýšil. V súčasnosti je rakovina pečene druhou hlavnou príčinou úmrtia na rakovinu vo svete. Nie sú dostupné žiadne dobré biomarkery na detekciu a analýzu rakoviny pečene alebo hepatocelulárnej (HCC). Obehová DNA by mohla byť dobrým biomarkerom pre rakovinu pečene. Pozrite sa na nasledujúcu citáciu od Lagbay a spoluautorov o možnosti použitia cirkulujúcej DNA na diagnostiku rakoviny pečene: ➾ Hypermethylácia RASSF1A, p15 a p16 bola navrhnutá ako skoré diagnostické nástroje v retrospektívnej štúdii zahŕňajúcej 50 pacientov s HCC. Podpísanie štyroch aberantly metylovaných génov (APC, GSTP1, RASSF1A a SFRP1) bolo tiež testované na diagnostickú presnosť, zatiaľ čo metylácia RASSF1A bola hlásená ako prognostický biomarker. Nasledujúce štúdie analyzovali ctDNA u pacientov s HCC pomocou technológií hlbokého sekvenovania … Výrazne boli detekované aberantné kópie DNA kópií na dvoch nosičoch HBV bez predchádzajúcej histórie HCC v čase odberu krvi, ale v priebehu sledovania vyvinuli HCC. Toto zistenie otvorilo dvere na vyhodnotenie variácie počtu kópií v ctDNA ako skríningový nástroj pre skorú detekciu HCC.
Word From Verywell
Tekuté biopsie sú vzrušujúcim novým prístupom k genómovej diagnostike. V súčasnosti sú k dispozícii určité tekuté biopsie, ktoré ponúkajú komplexné molekulárne profilovanie, lekárom, ktoré dopĺňajú genetickú informáciu získanú z biopsie tkaniva. Existujú aj určité tekuté biopsie, ktoré sa môžu použiť namiesto biopsie tkaniva – keď biopsie tkaniva nie sú k dispozícii.
Je dôležité mať na pamäti, že v súčasnosti prebieha veľa testov na tekuté biopsie a je potrebné urobiť viac výskumov, aby sa objasnilo terapeutické využitie tejto intervencie.
